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技術(shù)文章
蛋白免疫印跡（WB）是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測特定樣品或提取物中某種特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝膠緊貼著膜放置，常用的膜是硝酸纖維素或PVDF（聚偏乙烯氟化物），在電流的作用下蛋白質(zhì)從凝膠遷移到膜上并且被固定。膜是凝膠蛋白質(zhì)的復(fù)制品，然后可以與抗體結(jié)合后進行染色。免疫印跡（WB）是一項通過凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白，然后再利用特異性抗體識別這些蛋白的技術(shù)。它是對蛋白進行定性和相對定量的重要檢測工具。
您在WB實驗時是否遇到無信號、高背景、多帶等問題？小編接下來將一一為您呈現(xiàn)這些問題的常見原因和解決方案。
Chapter1
無信號常見原因和解決方案
WB實驗時出現(xiàn)無信號或信號弱現(xiàn)象，小艾歸納整理發(fā)現(xiàn)，主要是靶標(biāo)自身特性和WB實驗流程中的樣本制備、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、洗膜和檢測等具體實驗細節(jié)問題會導(dǎo)致這一現(xiàn)象。接下來小艾跟大家詳細扒一扒具體細節(jié)有哪些。
1.靶點特性導(dǎo)致無信號的常見原因及解決方案
▼ 組織或細胞中靶標(biāo)蛋白含量低導(dǎo)致無信號或信號弱
可通過如下建議解決：
參考文獻或數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)（例如The Human Protein Atlas）等，確認靶標(biāo)蛋白是否在待檢組織或細胞中表達。我們總結(jié)了41個有表達特異性的熱門靶標(biāo)表達信息，供大家參考（附錄1）。
增加上樣量，至少上樣20-30μg蛋白。
濃縮使信號大化（例如檢測核蛋白要用核裂解物；檢測膜蛋白用膜裂解液，超速離心分離膜蛋白）。我們總結(jié)了58個熱門靶標(biāo)亞細胞定位信息，及其陽性對照供大家參考（附錄2）。
參考文獻或產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)增加靶標(biāo)蛋白表達。很多靶標(biāo)蛋白需要藥物誘導(dǎo)或其它特殊處理，其含量才能達到WB檢測范圍，我們整理了17個熱門靶標(biāo)蛋白在不同細胞系中藥物處理信息，及對應(yīng)產(chǎn)品供大家參考（附錄3）。
選擇確認表達靶標(biāo)蛋白的樣本作為陽性對照（可參考產(chǎn)品說明書中提供的陽性對照）。
附錄1 熱門靶標(biāo)蛋白表達及陽性對照
靶標(biāo)名稱 | 組織/細胞表達特異性（Uniprot） |
Alpha-synuclein | •Alpha-synuclein主要在大腦中表達，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前末梢高度表達。 |
•在除肝臟外的組織中也有少量表達。 | |
BDNF | •BDNF在海馬、杏仁核、大腦皮層和小腦等腦組織中高度表達。 |
•BDNF也表達于心臟、肺、骨骼肌、睪丸、前列腺和胎盤中。 | |
Caspase-3 /cleaved Caspase-3 | •在肺、脾、心臟、肝臟和腎臟中高度表達。 |
•腦和骨骼肌內(nèi)中水平表達，睪丸低水平表達。 | |
•在許多細胞系中表達，在免疫系統(tǒng)細胞中的表達最高。 | |
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附錄2 熱門靶標(biāo)蛋白亞細胞定位及陽性對照
靶標(biāo)名稱 | 蛋白亞細胞定位（Uniprot） | 陽性對照 |
Alpha-synuclein | 細胞膜，細胞質(zhì)，細胞核；也分泌于細胞連接、突觸和多巴胺能神經(jīng)元膜結(jié)合處。 | •WB：HAP1、HEK293-T細胞裂解液 ；人、大鼠腦組織裂解液 ；重組人Alpha-synuclein蛋白（?ab51189） 。 |
BDNF | 分泌型 | •WB：重組人/小鼠/大鼠BDNF蛋白（?ab9794） ；人，大鼠和小鼠的腦，海馬和小腦組織裂解液 |
BrdU | 細胞核 | •IHC：來自BrdU 處理的小鼠的未染色切片(?ab129956)。 •ICC：BrdU處理的HeLa 細胞。 |
附錄3 熱門靶標(biāo)蛋白陽性對照及藥物處理條件
靶標(biāo)名稱 | 細胞系 | 試劑處理 | 產(chǎn)品 |
c-Fos | HeLa | 血清饑餓36小時，20% FBS（2小時） | ?ab214672 |
Jurkat | 血清饑餓過夜，PMA（200 nM， 4 小時） | ||
RAW 264.7 | 血清饑餓過夜，PMA（200 nM， 4 小時） | ||
Cleaved Caspase-3 | HAP1 | 星形孢菌素（2 μM， 24小時） | ?ab32042 |
HeLa | 星形孢菌素（2 μM， 24小時） | ||
cleaved N-terminal DFNA5 / GSDME | SH-SY5Y | Etoposide（60 μM ，14小時） | ?ab222408 |
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▼組織或細胞中修飾后（磷酸化、乙酰化和泛素化等）的靶標(biāo)蛋白含量底，可導(dǎo)致無信號或信號弱現(xiàn)象
可通過如下建議解決：
通常情況下，在未處理的組織或細胞中，大部分翻譯后修飾狀態(tài)下的蛋白含量較少。
參考文獻或產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)增加靶標(biāo)蛋白含量。我們整理了25個熱門靶標(biāo)，在不同細胞系中檢測其翻譯后修飾形式，需藥物處理條件及對應(yīng)的產(chǎn)品，供大家參考（附錄3）。
裂解緩沖液中使用相應(yīng)去修飾酶抑制劑。（例如靶蛋白磷酸化檢測，裂解液中需增加磷酸酶抑制劑）
陽性對照（參考產(chǎn)品說明書中誘導(dǎo)試劑和條件，處理樣本。）
附錄3 翻譯后修飾靶標(biāo)蛋白陽性對照及藥物處理條件
靶標(biāo)名稱 | 細胞系 | 試劑處理 | 產(chǎn)品 |
eNOS(phospho S1177) | HUVEC | Pervanadate（100 uM，10分鐘） | ?ab215717 |
JAK2(phospho Y1007 + Y1008) | Jurkat | Pervanadate（50 mM ，5分鐘） | ?ab32101 |
C6 | Pervanadate（50 mM，5分鐘） | ||
Hepa1-6 | Pervanadate（100 µM，30分鐘） | ||
MEF | Pervanadate（100 µM，30分鐘） | ||
MLKL(phospho S345) | L-929 | 20 ng/ml TNF alpha，100 nM Smac mimetic和20 µM z-VAD（8小時） | ?ab196436 |
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注：具體細胞系處理信息請參考產(chǎn)品說明書
▼靶標(biāo)蛋白是分泌型蛋白，檢測時分泌到細胞外，若檢測的樣本為全細胞裂解液，會出現(xiàn)無信號或信號弱現(xiàn)象
可通過如下建議解決：
使用 Brefeldin A（BFA）抑制蛋白分泌，提取全細胞裂解液。
如果全細胞裂解液中檢測不到靶蛋白，建議提取細胞培養(yǎng)上清中的蛋白。
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